Validación del método m-hidroxibifenilo para la cuantificación de ácido urónico en polisacáridos purificados de Streptococcus pneumoniae / Validation of the m-hydroxibiphenil method for the quantitation of uronic acid in purified Streptococcus pneumoniae polysaccharides

Introducción: la complejidad y diversidad estructural de los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae hace que la metodología analítica necesaria para la caracterización y control de calidad sea engorrosa. El método colorimétrico m‒hidroxibifenil desarrollado por Blumenkrantz y Asboe‒Hansen en el año 1973, permite contrarrestar las desventajas del método propuesto en la Farmacopea Europea 6ta Edición, 2011. Objetivo: validar el método m‒hidroxibifenilo para cuantificar ácido urónico en polisacáridos purificados de streptococcus pneumoniae. Métodos: se determinó el tiempo de vigencia de la solución de tetraborato de sodio responsable de generar la respuesta analítica y se seleccionó una metodología para la cuantificación de ácido urónico por el método del m‒hidroxibifenilo se emplea una solución estándar de ácido galacturónico a 1 mg/mL. Se realizó una evaluación de los parámetros de validación: linealidad, exactitud, precisión, rango y especificidad, según exigencias actuales. Además se comparó con el método del carbazol descrito en la Farmacopea Europea 6ta Edición, 2011 para la cuantificación de ácido urónico.Resultados: se demostró que el tiempo de vida útil de la solución de tetraborato de sodio fue de 24 h. El método del m‒hidroxibifenilo fue específico, lineal, exacto y preciso en el rango de 2‒20 μg/mL porque se cumplieron satisfactoriamente los criterios de aceptación establecidos para cada uno de ellos. La comparación del método propuesto con el método normalizado reveló que no existieron diferencias estadísticamente significativas entre ambos. Conclusión: el método colorimétrico del m‒hidroxibifenilo resultó válido para el control de calidad de las muestras de polisacárido purificado de Streptococcus pneumoniae, dando resultados comparables con el método recomendado en la Farmacopea Europea, 2011(AU)

Introduction: complexity and diversity in the structure of Streptococcus pneumoniae capsular makes the analytical methodology for characterization and quality control a troublesome aspect. The colorimetric m/hydroxibiphenil method devised by Blumenklrantz and Asboe-Hansen in 1973 allows reducing the disadvantages of the suggested method in the European Pharmacopea 6th edition, 2011. Objective: to validate the m-hydroxybiphenil method for quantitation of uronic acid in purified Streptococcus pneumonia polysaccharides. Methods: the length of validity of a sodium tetraborate solution, responsible for generating the analytical response, was estimated, and additionally, a methodology for quantitation of uronic acid by the m-hydroxybiphenil method was selected in which a standard galacturonic acid solution at 1mg/ml was used. The validation parameters were evaluated as follows: linearity, accuracy, precision, range and specificity, according to the present requirements. This method was compared with the carbazol method described in the European Pharmacopea 6th edition, 2011 for quantitation of uronic acid. Results: it was demonstrated that the useful lifetime of the sodium tetraborate solution was 24 hours. The m-hydroxybiphenil method was specific, linear, accurate and precise in the range of 2 to 20 ?g/mL because the set acceptance criteria were satisfactorily complied with for each of them. The comparison of the suggested method with the standardized method yielded that no statistically significant differences exist between them. Conclusions: the colorimetric m-hydroxybiphenil method proved to be valid for the quality control of purified Streptococcus pneumonia polysaccharide samples and the results are comparable to those of the recommended method in the European Pharmacopea, 2011(AU)

Validación del método m­hidroxibifenilo para la cuantificación de ácido urónico en polisacáridos purificados de Streptococcus pneumoniae / Validation of the m-hydroxibiphenil method for the quantitation of uronic acid in purified Streptococcus pneumoniae polysaccharides

Introducción: la complejidad y diversidad estructural de los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae hace que la metodología analítica necesaria para la caracterización y control de calidad sea engorrosa. El método colorimétrico m‒hidroxibifenil desarrollado por Blumenkrantz y Asboe‒Hansen en el año 1973, permite contrarrestar las desventajas del método propuesto en la Farmacopea Europea 6ta Edición, 2011. Objetivo: validar el método m‒hidroxibifenilo para cuantificar ácido urónico en polisacáridos purificados de streptococcus pneumoniae. Métodos: se determinó el tiempo de vigencia de la solución de tetraborato de sodio responsable de generar la respuesta analítica y se seleccionó una metodología para la cuantificación de ácido urónico por el método del m‒hidroxibifenilo se emplea una solución estándar de ácido galacturónico a 1 mg/mL. Se realizó una evaluación de los parámetros de validación: linealidad, exactitud, precisión, rango y especificidad, según exigencias actuales. Además se comparó con el método del carbazol descrito en la Farmacopea Europea 6ta Edición, 2011 para la cuantificación de ácido urónico. Resultados: se demostró que el tiempo de vida útil de la solución de tetraborato de sodio fue de 24 h. El método del m‒hidroxibifenilo fue específico, lineal, exacto y preciso en el rango de 2‒20 µg/mL porque se cumplieron satisfactoriamente los criterios de aceptación establecidos para cada uno de ellos. La comparación del método propuesto con el método normalizado reveló que no existieron diferencias estadísticamente significativas entre ambos(AU) Conclusión: el método colorimétrico del m‒hidroxibifenilo resultó válido para el control de calidad de las muestras de polisacárido purificado de Streptococcus pneumoniae, dando resultados comparables con el método recomendado en la Farmacopea Europea, 2011(AU)

Introduction: complexity and diversity in the structure of Streptococcus pneumoniae capsular makes the analytical methodology for characterization and quality control a troublesome aspect. The colorimetric m/hydroxibiphenil method devised by Blumenklrantz and Asboe-Hansen in 1973 allows reducing the disadvantages of the suggested method in the European Pharmacopea 6th edition, 2011. Objective: to validate the m-hydroxybiphenil method for quantitation of uronic acid in purified Streptococcus pneumonia polysaccharides. Methods: the length of validity of a sodium tetraborate solution, responsible for generating the analytical response, was estimated, and additionally, a methodology for quantitation of uronic acid by the m-hydroxybiphenil method was selected in which a standard galacturonic acid solution at 1mg/ml was used. The validation parameters were evaluated as follows: linearity, accuracy, precision, range and specificity, according to the present requirements. This method was compared with the carbazol method described in the European Pharmacopea 6th edition, 2011 for quantitation of uronic acid. Results: it was demonstrated that the useful lifetime of the sodium tetraborate solution was 24 hours. The m-hydroxybiphenil method was specific, linear, accurate and precise in the range of 2 to 20 ?g/mL because the set acceptance criteria were satisfactorily complied with for each of them. The comparison of the suggested method with the standardized method yielded that no statistically significant differences exist between them. Conclusions: the colorimetric m-hydroxybiphenil method proved to be valid for the quality control of purified Streptococcus pneumonia polysaccharide samples and the results are comparable to those of the recommended method in the European Pharmacopea, 2011(AU)

Ensayo colorimétrico de hibridación en microplacas para la detección de Mycobacterium leprae 16s rRNA en muestras clínicas

Se ha desarrollado un ensayo colorimétrico de hibridación en microplacas para simplificar la detección de Mycobacterium leprae en muestras clínicas. La técnica detecta los productos amplificados por un ensayo muy sensible RT-PCR con diana sobre una secuencia especie-específica del rRNA 16S bacteriano. El test detectó hasta 10 bacilos aislados de los nódulos linfáticos de ratones desnudos infectados o biopsias cutáneas humanas. La sensibilidad para el diagnóstico en nuestras clínicas se evaluó en 58 biopsias cutáneas de 58 pacientes de lepra sin tratar. El ensayo detectó amplificados RT-PCR de M. leprae en el 100 por ciento de las biopsias de pacientes con lepra multibacilar y el 80 por ciento de biopsias de pacientes paucibacilares, con una sensibilidad total de 91.3 por ciento. El test resultó ser muy específico ya que no se detectaron amplificaciones en las biopsias de pacientes normales o afectados de otras enfermedades distintas a la lepra. La variante colorimétrica es más rápido, sensible y simplifica la detección de los amplificados RT-PCR comparado con el análisis por Southern blot. Puede ser útil para el diagnóstico de los casos difíciles de lepra y como el RNA se degrada rápidamente después de la inactivación celular siendo útil para la evaluación de la respuesta al tratamiento y distinción de recidivas de reacción (AU)

Simple colorimetric microtiter plate hybridization assay for detection of amplified Mycobacterium leprae DNA.

The detection of amplified products resulting from polymerase chain reactions (PCRs) remains a complicated process. To simplify the detection procedures, we developed a colorimetric microtiter plate hybridization assay for the specific detection of 5'-biotinylated PCR fragments of Mycobacterium leprae DNA. For this assay, an M. leprae DNA capture probe was made and immobilized on the wells of a microtiter plate. Hybridization of the biotin-labeled PCR fragments was detected through enzymatic color development. The resulting optical densities showed a logarithm-linear relationship with the amount of template DNA and corresponded to the intensity of the bands obtained through gel analysis and Southern blotting of the PCR products. The sensitivity of the assay was found to be 125 fg of genomic M. leprae DNA, or 20 lysed bacilli, revealing a detection limit similar to that of agarose gel analysis. The efficient coamplification of human DNA was used as a positive control for the presence of inhibitory substances in clinical material. For detection of human PCR products, a human DNA capture probe was also constructed for the colorimetric assay. This dual setup for hybridization, which thus detected both M. leprae and human DNA PCR products, was useful for ascertaining the presence of inhibiting substances in clinical specimens. All biopsy specimens (n = 10) from untreated patients with leprosy were positive. Apparently, this assay is more sensitive than microscopy, because biopsy specimens from half of the patients were negative upon histopathological examination. Biopsy specimens from three treated patients were negative, as were those from the three patients who did not have leprosy. We conclude that this colorimetric assay can replace agarose gel analysis and Southern hybridization, because it is as sensitive as those methods. Its advantages over conventional gel analysis and Southern hybridization are that it is less cumbersome and more rapid.

Colorimetric estimation of uronic acids using 2-hydroxydiphenyl as a reagent.

Conditions allowing substitution of 3-hydroxydiphenyl, recommended by N. Blumenkrantz and G. Asboe-Hansen (Anal. Biochem. 54, 484-489, 1973) as a reagent for estimation of hexuronic acids by the much cheaper 2-hydroxydiphenyl were investigated. The absorption maximum of a color product formed by glucuronic acid and 2-hydroxydiphenyl was found to be at 475 nm. Using this wavelength for measurement, and slightly modified reaction conditions, the sensitivity achieved by using both reagents was found to be comparable. The only interference was that of DNA, encountered in nucleic acid-rich unpurified soft tissues extracts.